Cy3   TUNEL Assay Apoptosis Detection Kit

產(chǎn)品描述

細(xì)胞凋亡的一個顯著特點是細(xì)胞染色體 DNA 的降解，這是一個較普遍的現(xiàn)象。這種降解非常特異并有規(guī)律，所產(chǎn)生的不同長度的 DNA 片段約為 180 bp-200 bp 的整數(shù)倍，表現(xiàn)為瓊脂糖凝膠電泳中呈現(xiàn)特異的梯狀 Ladder 圖譜，本試劑盒采用 TUNEL 法，應(yīng)用末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)在凋亡細(xì)胞斷裂DNA 的3′-OH末端催化摻入Cy3-dUTP。 Cy3-dUTP標(biāo)記的 DNA 可以用熒光顯微鏡直接觀察或者用流式細(xì)胞儀定量。 TUNEL 法可以選擇性的檢測凋亡細(xì)胞， 而非壞死細(xì)胞或因輻照和藥物治療而造成的 DNA 鏈斷裂的細(xì)胞。TUNEL 實驗中， TdT 酶催化 dUTP 摻入斷裂的 DNA 鏈的3′-OH末端。抗原標(biāo)記的 dUTP（如digoxin-dUTP、生*素-dUTP），因為它可以直接進(jìn)行原位檢測，是一種更快速、直接的檢測手段。

訂購信息

產(chǎn)品組分

運(yùn)輸與保存

藍(lán)冰運(yùn)輸。-20℃避光保存，有效期24個月。【注】：避免反復(fù)凍融。

實驗材料（自備）

PBS緩沖液（1×，pH~7.4）

0.2% Triton X-100（PBS配制）

0.1% Triton X-100（PBS配制，其中含5 mg/mL BSA）

4%多**醛（PBS配制）

免疫組化筆

脫蠟溶劑（石蠟切片樣本）

石蠟切片處理相關(guān)試劑

抗熒光淬滅封片劑

ddH₂O

使用方法

一、實驗設(shè)計

1. 陽性對照（可選）：

　　DNase I處理制備陽性對照載玻片。DNase I可以消化單鏈或雙鏈DNA產(chǎn)生單脫氧核苷酸或單鏈或雙鏈的寡脫氧核苷酸的核酸內(nèi)切酶，人為造成細(xì)胞凋亡。

2. 陰性對照（可選）：

　　使用不含TdT Enzyme的TUNEL Reaction Buffer，用ddH₂O替代TdT Enzyme。

3. 實驗處理組。

4. 實驗對照組。

二、實驗步驟

1. 樣本準(zhǔn)備：

對于貼壁細(xì)胞或細(xì)胞涂片

（1）PBS清洗1次。【注】：如果擔(dān)心細(xì)胞涂片的細(xì)胞貼得不牢，可以干燥樣品使細(xì)胞貼得更牢。

（2）固定：加入適量4%多**醛（PBS配制），室溫固定30 min。PBS清洗2次。

（3）通透：加入適量0.2% Triton X-100（PBS配制），室溫通透20 min。PBS清洗2次。

（4）轉(zhuǎn)步驟2. TUNEL 反應(yīng)。

對于懸浮細(xì)胞或細(xì)胞懸液

（1）收集細(xì)胞（ 3-5×10⁶個細(xì)胞），1000 rpm離心5 min，PBS清洗2次。

（2）固定：加入適量4%多**醛（PBS配制）充分重懸細(xì)胞，4℃固定30 min。2000 rpm離心5 min，PBS清洗2次。

（3）通透：加入適量0.2% Triton X-100（PBS配制），室溫通透20 min。2000 rpm離心5 min，PBS清洗2次。

（4）轉(zhuǎn)步驟2. TUNEL 反應(yīng)。

石蠟組織切片

（1）脫蠟與水化：將切片樣本依次放入二甲苯I（10 min）→ 二甲苯II（10 min）→ 100％乙醇I（5 min）→ 100％乙醇II（5 min）→ 95%乙醇（5 min）→ 90%乙醇（5 min）→ 80%乙醇（5 min）→ 70%乙醇（5 min）→ ddH2O沖洗5 min，沖洗2次。【注】：二甲苯有毒，易揮發(fā)，請在通風(fēng)櫥中進(jìn)行此操作。

（2）用濾紙吸干切片樣本周圍液體，用免疫組化筆圈好樣本輪廓，以便下游通透與標(biāo)記。

注：若在后續(xù)實驗操作中發(fā)現(xiàn)免疫組化筆畫的輪廓圈被破壞，需及時補(bǔ)畫。

（3）通透：按1: 100的比例，將2 mg/mL的Proteinase K溶液用PBS稀釋至終濃度20 µg/mL，在每個樣本上滴加100 µL，使溶液覆蓋全部樣本區(qū)域，20-37℃孵育20 min。【注】：Proteinase K可通透細(xì)胞膜和核膜，從而使后續(xù)步驟的染色試劑充分進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)行反應(yīng)，提高標(biāo)記效率。孵育時間過長會增加組織切片在后續(xù)洗滌步驟中從載波片上脫落的風(fēng)險，過短則可能造成透性處理不充分，影響標(biāo)記效率。為得到更好的結(jié)果，Proteinase K的濃度、孵育時間、溫度需根據(jù)不同類型組織樣本進(jìn)行優(yōu)化。

（4）PBS漂洗切片2次，每次5 min，用濾紙吸去多余的液體，將處理好的樣本放在濕盒中保持濕潤。

注：這一步必須把Proteinase K洗滌干凈，否則會嚴(yán)重干擾后續(xù)的標(biāo)記反應(yīng)。

（5）轉(zhuǎn)步驟2. TUNEL 反應(yīng)。

冰凍組織切片

（1）固定：取出冰凍切片，并回溫至室溫。加入適量4%多**醛（PBS配制），室溫固定30 min。PBS漂洗2次，每次10 min。【注】：若是擔(dān)心甲醛清洗不干凈，影響最終染色效果?？稍诩兹┕潭ㄍ瓿珊蠹尤脒m量2 mg/mL 甘*酸清洗 10 min，中和殘留的固定液，再進(jìn)行PBS清洗。

（2）用濾紙吸干切片樣本周圍液體，用免疫組化筆圈好樣本輪廓，以便下游通透與標(biāo)記。

注：若在后續(xù)實驗操作中發(fā)現(xiàn)免疫組化筆畫的輪廓圈被破壞，需及時補(bǔ)畫。

（3）通透：按1: 100的比例，將2 mg/mL的Proteinase K溶液用PBS稀釋至終濃度20 µg/mL，在每個樣本上滴加100 µL，使溶液覆蓋全部樣本區(qū)域，20-37℃孵育20 min。【注】：Proteinase K可通透細(xì)胞膜和核膜，從而使后續(xù)步驟的染色試劑充分進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)行反應(yīng)，提高標(biāo)記效率。孵育時間過長會增加組織切片在后續(xù)洗滌步驟中從載波片上脫落的風(fēng)險，過短則可能造成透性處理不充分，影響標(biāo)記效率。為得到更好的結(jié)果，Proteinase K的濃度、孵育時間、溫度需根據(jù)不同類型組織樣本進(jìn)行優(yōu)化。

（4）PBS漂洗切片2次，每次5 min，用濾紙吸去多余的液體，將處理好的樣本放在濕盒中保持濕潤。【注】：這一步必須把Proteinase K洗滌干凈，否則會嚴(yán)重干擾后續(xù)的標(biāo)記反應(yīng)。

（5）轉(zhuǎn)步驟2. TUNEL 反應(yīng)。

陽性處理（僅陽性對照進(jìn)行此步驟，其他樣品直接進(jìn)行TUNEL反應(yīng)步驟）

（1）按1: 10的比例用ddH2O將10× DNase I Buffer稀釋成1× DNase I Buffer備用。

（2）滴加100 µL 1× DNase I Buffer到已處理的樣本上，覆蓋全部樣本區(qū)域，室溫平衡5 min。

（3）用1× DNase I Buffer以1: 100稀釋DNase I (2 U/μL)至終濃度20 U/mL的工作液。

（4）棄去Buffer，加入100 μL濃度為20 U/mL的 DNase I工作液，室溫孵育10 min。

（5）棄去DNase I工作液，PBS清洗2次。

（6）轉(zhuǎn)步驟2. TUNEL 反應(yīng)。

2. TUNEL 反應(yīng)

配制TUNEL反應(yīng)液（即用即配）：

對于貼壁細(xì)胞、細(xì)胞涂片或組織切片

（1）每個樣本加入50 μL TUNEL反應(yīng)液，使反應(yīng)液均勻覆蓋樣本。37℃避光孵育適宜的時間（細(xì)胞推薦染色時間30min-1h，組織染色時間推薦2h）。【注】：50 μL TUNEL反應(yīng)液適合涂片、切片或96孔板（其他不同孔板可以適當(dāng)調(diào)整TUNEL反應(yīng)液體積，覆蓋細(xì)胞即可）。如果待檢測的樣品為涂片、切片或在24孔板、12孔板或6孔板中，可以使用防蒸發(fā)膜，或自行嘗試使用自封袋或者其它適當(dāng)材料自行裁剪成比孔略小的圓形塑料片，滴加TUNEL反應(yīng)液后覆蓋在樣品上，可以防止TUNEL反應(yīng)液蒸發(fā)，并且使TUNEL反應(yīng)液均勻覆蓋樣本。

（2）棄去TUNEL 反應(yīng)液，PBS漂洗2次，每次5 min。【注】：為了降低背景，PBS漂洗切片1次后，可再用0.1% Triton X-100（PBS配制，其中含5 mg/mL BSA）漂洗3次，每次 5 min，這樣游離的未反應(yīng)的標(biāo)記物可以清除較干凈。

（3）（可選）每個樣本加入適量濃度為5 μg/mL 的DAPI染液，室溫避光孵育5 min。染色完成后，棄去DAPI染液，PBS漂洗2次，每次5 min。

（4）（可選）切片封片：將切片依次在純水、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、無水乙醇中浸沒5 min，最后將切片樣本置于染色缸中以新鮮的二甲苯浸泡，透明化處理2次，每次5 min。脫水完成后，擦去切片周圍的液體，每個樣本滴加50 μL抗熒光淬滅封片劑（抗熒光淬滅封片劑可能會不適用于某些染料，實驗前建議進(jìn)行預(yù)實驗測試匹配性），蓋上蓋玻片，用鑷子的鈍端輕輕敲擊蓋玻片，去除氣泡以使封片。

（5）用濾紙吸去多余的液體，向樣本區(qū)域加100 μL PBS保持樣本濕潤，立即在熒光顯微鏡下觀察。

對于懸浮細(xì)胞或細(xì)胞懸液

（1）每個樣本管加入50 μL TUNEL反應(yīng)液輕輕重懸細(xì)胞，37℃避光孵育30~60 min。每隔15 min用微量移液器輕輕重懸細(xì)胞。

（2）2000 rpm 離心5 min，棄去TUNEL 反應(yīng)液，加入適量0.1% Triton X-100（PBS配制，其中含5 mg/mL BSA）輕輕重懸細(xì)胞，并清洗2次。

（3）每個樣本管加入100 μL濃度為5 μg/mL的DAPI染液，室溫避光孵育5 min。

（4）加入400 μL PBS重懸細(xì)胞，立即用流式細(xì)胞儀檢測或進(jìn)行涂片后在熒光顯微鏡下觀察。

注意事項

1. 本產(chǎn)品僅限于科學(xué)實驗研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領(lǐng)域。

2. 使用前請將產(chǎn)品瞬時離心至管底，再進(jìn)行后續(xù)實驗。

3. 染色背景較重或非特異性著色明顯時可適當(dāng)減少染色時間。

4. 實驗時建議增加陰性對照和陽性對照組。

5. 組分A使用時請佩戴口罩、手套，如接觸皮膚，請立即用大量水沖洗。

6. 熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

7. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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