一文帶你了解蛋白酶K的知識(shí)
更新時(shí)間:2021-07-27 點(diǎn)擊次數(shù):2284
蛋白酶K是一種以絲氨酸為活性中心的枯草類蛋白酶,具有廣泛的底物特異性,特別優(yōu)先分解與疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸C末端鄰接的酯鍵和肽鍵??稍诙喾N不同鹽、變性劑、去污劑、pH值和溫度條件下進(jìn)行分解蛋白作用。在提取DNA和RNA的緩沖液中具有很高的活性,主要用于DNA、RNA制備過(guò)程中蛋白的消化。
一、分子結(jié)構(gòu)
蛋白酶K由一條肽鏈組成,包含277個(gè)氨基酸殘基,相對(duì)分子質(zhì)量為28930。活性部位由D39、H69和S224組成,底物識(shí)別位點(diǎn)主要為G100-Y104和S132-G136兩個(gè)片段。蛋白酶K的氨基酸序列與枯草芽孢桿菌蛋白酶具有高度同源性,因此被劃分為枯草芽孢桿菌蛋白酶類。蛋白酶K包含兩個(gè)二硫鍵(C34-C124,C179-C248),兩個(gè)色氨酸殘基(W8,W212)和一個(gè)游離半胱氨酸(C73)。X射線晶體學(xué)研究表明,蛋白酶K的三維結(jié)構(gòu)為一個(gè)明確的球形折疊。蛋白酶K屬于α/β類蛋白質(zhì),包含6個(gè)α-螺旋,15個(gè)β-折疊和一個(gè)3/10螺旋。
二、熒光性
蛋白酶K在295nm處被激發(fā),它的熒光性由兩個(gè)色氨酸殘基W8和W212決定。但是,兩個(gè)色氨酸的光反應(yīng)活性表現(xiàn)不同,W212要活潑得多。在pH3~9范圍內(nèi),色氨酸熒光量子產(chǎn)率恒定。對(duì)已激發(fā)的色氨酸進(jìn)行熱力滅活時(shí),活化能需達(dá)到54kJ/mol。這個(gè)值大幅地高于來(lái)自微生物的其他蛋白酶,因此可用來(lái)解釋蛋白酶K較高的熱穩(wěn)定性。
三、酶學(xué)性質(zhì)
蛋白酶K具有很高的切割活性,底物識(shí)別位點(diǎn)能和底物組成一個(gè)3股的反平行β片層,可催化脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵斷裂。α-螺旋是保持蛋白酶K活性中心構(gòu)象穩(wěn)定性的主要結(jié)構(gòu)。α-螺旋共包含90個(gè)氨基酸殘基,占?xì)埢倲?shù)的1/3,大部分殘基處在伸展的β-折疊結(jié)構(gòu)中。這使得整個(gè)分子有序度低,變性熵不大,比變性焓值極低,反映了酶穩(wěn)定性的本質(zhì)。分子中兩個(gè)二硫鍵及兩個(gè)Ca2+也對(duì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定性有貢獻(xiàn)。pH、溫度、Ca2+、激活劑和抑制劑等是影響蛋白酶K活力的主要因素。